Nachtwächter Larry Daley (Ben Stiller) hat sich inzwischen zum erfolgreichen Geschäftsmann gemausert. Eines Tages erhält er einen Notruf von Jedediah (Owen Wilson). Der Miniatur-Cowboy wurde zusammen mit anderen Ausstellungsstücken von New York ins Archiv der Smithsonian Institution nach Washington, D.C. verfrachtet. Auch dort erwachen die Figuren nachts zum Leben und treiben Schabernack. Pharao Kahmunrah (Hank Azaria) plant allerdings Furchtbares. Zusammen mit Iwan dem Schrecklichen (Christopher Guest), Napoleon Bonaparte (Alain Chabat) und Al Capone (Jon Bernthal) will er die Weltherrschaft übernehmen. Sofort eilt Larry in die Hauptstadt, um dem größenwahnsinnigen Spuk ein Ende zu bereiten.
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